上海黄浦工业污泥处理厂家-颗粒污泥性质和微生物群落差异性研究

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　　厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)因为无需曝气、节省碳源、产泥量少, 可节约能耗和降低运行成本, 成为目前污水处理脱氮工艺的研究热点.但厌氧氨氧化菌的世代周期长达11 d, 且对环境因素变化敏感, 因此有效富集和截留厌氧氨氧化菌是保证工艺稳定运行、提高脱氮效率的必要条件.颗粒污泥具有良好的沉降性能和抗冲击能力, 可保持大量生物量, 形成厌氧氨氧化颗粒污泥是保障良好的脱氮性能的重要形式.

　　现阶段学者们对厌氧氨氧化颗粒污泥的形成机制和快速启动进行了大量研究, 然而厌氧氨氧化颗粒污泥是一个复杂的微生物共生系统, 不同的培养条件如水流剪切力、基质浓度、氮负荷导致颗粒污泥性质具有差异性, 这些差异性还不明确.膨胀颗粒污泥床(expanded granular sludge bed, EGSB)反应器和上升式厌氧污泥床(up-flow anaerobic sludge bed, UASB)反应器在培养厌氧氨氧化颗粒污泥方面应用广泛.然而两种反应器在结构、性能和运行参数上都有所不同, 势必导致培养的厌氧氨氧化颗粒污泥特性及微生物群落结构上有所差异, 进而影响其脱氮性能.

　　本文在不同的上升流速、水力停留时间、基质浓度以及氮负荷的培养条件下, 研究了EGSB和UASB反应器中厌氧氨氧化颗粒污泥特性的差异性, 并采用高通量测序法分析了不同运行条件下厌氧氨氧化颗粒污泥颗粒的微生物种群特征, 以期为厌氧氨氧化颗粒污泥的工程化应用提供参考.

　　1 材料与方法

　　1.1 反应器与实验用水

　　EGSB反应器反应区高度为60 cm, 内径为6 cm, 外径12 cm, 有效容积约为1.7 L, 高径比约为10:1, 通过内循环系统控制水流上升速度, 反应器顶部三相分离区澄清液直接经循环泵从底部回流, 不接触空气.UASB反应器反应区的内径8 cm, 沉淀区内径10 cm, 高127 cm, 持水高度120 cm, 有效容积为19.7 L.两个反应器均由有机玻璃制成, 密封保障厌氧环境, 依靠外层的水浴夹套保持温度在(32±1)℃, 整体用遮阳塑料膜盖住避光, 并通过蠕动泵控制进水流量.

　　实验用水采用人工模拟废水, 其中的氨氮和亚硝酸盐通过添加NH4Cl和NaNO2获得, 浓度按需配比.CaC12 0.18 g·L-1, KH2PO4 0.03 g·L-1, MgSO4 0.30 g·L-1, KHCO3 0.50 g·L-1, 1 L配水添加1 mL微量元素Ⅰ和Ⅱ.微量元素Ⅰ组分(g·L-1)：EDTA 5, FeSO4 5;微量元素Ⅱ组分(g·L-1)：EDTA 15, ZnSO4·7H2O 0.43, CoCl2·6H2O 0.24, MnCl2·4H2O 0.99, CuSO4·5H2O 0.25, NaMoO4·2H2O 0.22, NiCl2·6H2O 0.19, NaSeO4·10H2O 0.21, H3BO4 0.014.进水pH控制在7.5±0.5.

　　1.2 污泥来源

　　接种污泥取自实验室培养的成熟的厌氧氨氧化絮状污泥, SS=5.2 g·L-1, VSS=2.4 g·L-1, VSS/SS=46.20%, 总氮容积去除负荷为0.7 kg·(m3·d)-1.EGSB和UASB反应器种泥接种体积比分别为60%和50%.采用EGSB和UASB反应器连续培养厌氧氨氧化颗粒污泥, 经过384 d的培养, 两者均获得了较好的脱氮效果, 且均形成颗粒污泥.培养过程中, 取反应器启动时的种泥, EGSB反应器运行第53、177和384 d以及UASB反应器运行第384 d时反应器内混合均匀的污泥样品. 5个污泥样品名称分别标记为种泥、E.53 d、E.177 d、E.384 d和U.384 d.取样期间反应器的运行工况和水质处理效果如表 1所示.

 

 表 1 取样期间反应器的运行工况及处理效能

　　1.3 指标测定

　　污泥宏观形态特征采用iPhone8后置摄像头拍摄记录, 微观形态与结构特征采用微生物光学显微镜(OLYMPUS CX41, 日本)和扫描电子显微镜(SEM, HITACHI S-4300, 日本)进行.扫描电镜样品制备参照Wu等[11]的方法进行, 具体如下：首先, 挑选部分颗粒污泥用磷酸缓冲液(pH=6.8)冲洗3~5次, 去除颗粒表面杂质;加入戊二醛(质量浓度=2.5%、pH=6.8)完全淹没泥样, 4℃冰箱固定12 h;分别使用不同浓度乙醇(50%、70%、80%和90%)依次脱水10~15 min, 再用100%无水乙醇脱水3次, 每次10~15 min;用乙醇:乙酸异戊酯(1:1)混合溶液、纯乙酸异戊酯各置换1次、每次15 min, 干燥8 h;采用离子溅射镀膜仪(IB-5Giko)在样品表面镀金属膜(厚度为1.5 mm);置于扫描电镜下观察待检样的微观性状及结构特征.颗粒污泥粒径采用激光粒度仪(MASTERSIZER 3000, Malvern, UK)进行测定.

　　1.4 微生物分析

　　采用Illumina MiSeq测序平台对5个样品微生物进行测序, 实验流程包括微生物组总DNA提取、目标片段PCR扩增、扩增产物回收纯化、扩增产物荧光定量、MiSeq文库构建和MiSeq测序.

　　2 结果与讨论

　　2.1 不同培养条件厌氧氨氧化颗粒污泥理化性质

　　2.1.1 表观形态

　　不同培养条件下污泥表观颜色与形态如图 1所示.接种污泥颜色为棕色, 呈絮状, 结构较为松散.EGSB反应器运行53 d出现小颗粒, 颜色由接种时的棕色进一步加深, 177 d后颗粒污泥粒径增长, 颜色砖红色, 第384 d污泥颗粒颜色加深, 颗粒化过程中污泥由棕色向棕红、红褐色转变.UASB反应器中培养384 d的颗粒污泥颜色暗红, 与EGSB反应器中第384 d的污泥相比颜色更暗.厌氧氨氧化菌因含有一系列血红素c蛋白(细胞色素c)而显示独特的红色.红色可以用作粗略评估比活度和反应器容量的指标.在不同的氮加载速率下, 厌氧氨氧化颗粒污泥的颜色可能会从胭脂红变为棕色和变为黑色.

 

 (a)种泥; (b)E.53 d; (c)E.177 d; (d)E. 384 d; (e)U. 384 d

图 1 不同培养条件下ANAMMOX污泥宏观形态

　　在显微镜下可以观察到厌氧氨氧化污泥颗粒化的过程中的外观变化, 起初厌氧氨氧化污泥呈不规则几何形, 微生物或分散或团簇在一起, 边缘呈现毛刺状(图 2).经过一段时间的培养, 絮体吸附在一起, 微生物在胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)的作用下相互吸附黏合形成紧实的颗粒状污泥.EPS是厌氧氨氧化颗粒污泥的重要组成部分, 它使细胞彼此粘附并促进微生物聚集, 有助于形成厌氧氨氧化颗粒污泥的水通道或气体隧道(0.4~18.9 μm), 影响着厌氧氨氧化颗粒污泥的质量传递和密度.EGSB反应器第384 d的颗粒污泥可以看出颗粒污泥形态圆滑饱满, 内部密实, 外层包裹着一层琼脂状的胞外聚合物, 与UASB反应器第384 d的颗粒污泥相比, 轮廓更为光滑, 主要原因是在EGSB反应器中有更高的上升流速, 较强水力冲刷使得颗粒污泥表面更光滑.

  (a)种泥; (b)E. 53d;(e)E.177d;(d)E. 384d;(e)U. 384d

图 2 不同培养条件下ANAMMOX污泥显微镜形态

　　2.1.2 颗粒污泥粒径分布

　　粒径分布是厌氧氨氧污泥颗粒化进程的一个重要表征参数.厌氧氨氧化污泥的粒径随着反应器运行而变化.起初接种污泥粒径 < 0.2 mm占67.10%(图 3), 平均粒径为0.15 mm.EGSB反应器运行至53 d, 粒径 < 0.2 mm的颗粒减少, >0.2 mm的颗粒增多, 出现了>1.5 mm粒径的颗粒, < 0.2、0.2~1.5和>1.5 mm的粒径数量占比分别为15.23%、83.77%和1.00%, 平均粒径增长到0.47 mm.EGSB反应器运行至177 d, 小粒径进一步向大粒径转变, 各粒径占比为6.05%、72.11%和21.84%, 运行至384 d时, 出现>3 mm粒径的颗粒污泥, 粒径占比由小到大分别为7.40%、58.90%、32.04%和1.66%, 平均粒径达到1.17 mm, 相比接种时增长了7.8倍.培养过程中, 粒径 < 0.2 mm的污泥呈现先减少后略微增加至稳定的趋势, 原因一方面是小颗粒污泥不断增长成大颗粒污泥, 在启动初期粒径变化最为明显;另一方面是有微生物不断繁殖增长, 聚集黏合成细小颗粒, 生成小颗粒的速度与颗粒增长的速度达到平衡.从颗粒污泥的粒径分布变化可以看出, 反应器中的颗粒粒径在0.2~1.5 mm的占比最大.UASB反应器运行至384 d时, 各范围的粒径占比为6.06%、60.05%、25.25%和8.64%, 平均粒径达到1.21 mm.对比EGSB反应器中的颗粒, UASB反应器中粒径>3 mm的颗粒占比更大, 且最大粒径为3.8 mm, 而EGSB反应器中最大粒径为3.1 mm, 主要的影响因素是水力条件.本实验中粒径在0.2~1.5 mm之间的占比最大, 有研究表明当颗粒直径为0.5~0.9 mm时, 厌氧氨氧化菌的丰度、活性和反应速率均得到提高, 1.0~1.5 mm粒径的厌氧氨氧化颗粒污泥具有最高活性.具体联系污水宝或参见http://www.dowater.com更多相关技术文档。

 

图 3 不同培养条件下ANAMMOX污泥粒径分布

　　2.1.3 颗粒污泥扫描电镜分析

　　图 4为不同时期的厌氧氨氧化污泥的扫描电镜图.起初接种污泥可以看到少量的杆菌和黏性物质, 由丝状纤维物质相互连接.随着颗粒的增大, 细菌微生物密集的聚集起来, 在EGSB反应器第177 d和UASB反应器第384 d, 颗粒污泥表面有大量球型细菌, EGSB反应器运行384 d, 颗粒污泥中大量球型菌、短杆菌、丝状菌大量共存.研究报道厌氧氨氧化颗粒污泥主要以球形或卵型的球菌聚集体为主, 粒径在0.8~1 μm之间.目前普遍认为, 厌氧氨氧化颗粒污泥包括4层结构(颗粒, 亚基, 微生物细胞簇和单细胞).Kang等的研究发现, 红色厌氧氨氧化颗粒污泥的表面具有类似于火山口的结构, 覆盖大量类似厌氧氨氧化细菌的球菌;棕色厌氧氨氧化颗粒污泥表面疏松, 几乎没有球菌存在, 大量丝状细菌和EPS相互缠结;而黑色厌氧氨氧化颗粒污泥的表面致密而光滑, 被大量的无机物覆盖, 看不到细菌.

 

(a)种泥; (b)E.53d;(c)E. 177d;(d)E. 384d;(e)U. 384d

图 4 不同培养条件下ANAMMOX污泥SEM图像

　　2.2 不同培养条件厌氧氨氧化颗粒污泥微生物群落结构分析

　　2.2.1 微生物多样性及丰度分析

　　5个污泥样品的测序量和OTU数较为接近, 分别在35 122~38 257和4 805~5 715之间.对于微生物群落而言, 有多种指数来反映其α多样性.不同的指数对于衡量群落多样性的侧重点各不相同, Chao1或ACE指数侧重于体现群落的丰富度(即群落中微生物成员如OTU的数量), 一般而言, Chao1或ACE指数越大, 表明群落的丰富度越高.由表 2可以看出接种污泥的Chao1和ACE指数均为1 398, 经EGSB反应器运行53~177 d, Chao1和ACE指数呈现下降趋势, 分别下降到1 219.83和1 376.72, 而培养至384 d时, Chao1和ACE指数上升到1 344.54和1 376.72, 和接种时的指数相差不大.说明反应器启动初期, 由于生存环境发生改变, 厌氧氨氧化颗粒污泥的种群多样性先下降, 在微生物适应了新的生长环境, 种群多样性又进一步丰富起来.而在UASB反应器运行384 d之后, 发现Chao1和ACE指数比接种污泥有所降低, 分别为1 111.07和1 114.34, 同时也低于EGSB反应器的384 d污泥样品, 这说明UASB反应系统中微生物种群较EGSB反应系统更为单一.与Chao1和ACE指数不同, Simpson指数更倾向于反映群落的均匀度(即各成员间的丰度差异大小), Simpson指数值越高, 表明优势菌群占总体生物菌群比例越大.而Shannon指数综合考虑了群落的丰富度和均匀度, 指示了生物群落组成复杂程度, 其值越大, 表明群落复杂程度越大. 5个样品中Simpson指数均在0.97以上, 差别不大, 说明本研究条件下不论在UASB反应器中还是EGSB反应器中, 成熟的厌氧氨氧化污泥颗粒化过程的优势种群占总体生物种群比例稳定.Shannon指数在EGSB反应器运行第53 d由接种时的7.62降低到7.09, 随后随着培养时间的增长而增加, 到384 d时增长到7.52, 说明群落的复杂程度与种群多样性呈一样的变化趋势.而UASB反应器中384 d的Shannon指数为7.18, 均低于接种污泥和EGSB反应器第384 d的污泥, 表明UASB反应系统中的微生物的多样性略低.

 

表 2 菌群微生物多样性指数

　　2.2.2 各阶段微生物在门分类层面上的比对

　　从门分类层面上的比对各阶段的微生物种群, 结果如图 5所示, 5个样品中丰富度占比较大的有变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、Patescibacteria门、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes).其中变形菌门(Proteobacteria)在5个样品中的占最大比例, 在35.61%~50.84%之间, 是各个样品的优势种群.厌氧氨氧化菌属于浮霉菌门, 接种污泥中浮霉菌门只有3.31%, 而在EGSB反应器运行53 d达到13.95%, 在177 d氮负荷为2.8kg·(m3·d)-1时浮霉菌门达到最大富集为23.45%, 但当容积氮负荷进一步升高至5.83kg·(m3·d)-1时, 浮霉菌门的比例下降至13.30%.而UASB反应器运行384 d后浮霉菌门达到12.27%, 略低于EGSB的第384 d, 该运行工况的氮负荷只有1.8kg·(m3·d)-1.氮去除负荷的波动直接影响着反应器优势微生物群落结构的演变.在运行384 d后, 两个反应器中的微生物群落结构比较类似, 其中变形菌门(Proteobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)是最主要的两大门类, 同时也存在着一定比例的厌氧异养菌如拟杆菌门和厚壁菌门.由于涉及到脱氮功能微生物主要来自变形菌门, 浮霉菌门和硝化螺旋菌门3种, 而运行后各阶段这3种菌门占总细菌的54.72%~63.14%, 因此脱氮效果较好, 达到84%~90%.

 

 图 5 各样品细菌分类(门)的群落组成相对百分比

　　2.2.3 各阶段微生物在属分类层面上的比对

　　对具有脱氮性能的变形菌门和浮霉菌门进行属水平分析.Denitratisoma和Limnobacter是变形菌门的主要菌种, 在接种污泥中分别占1.80%和8.60%(图 6), 其中Denitratisoma在两个反应器运行期间都有所增长, 在EGSB反应器第53、177和384 d分别占比19.47%、12.17%和14.98%, 在UASB反应器第384 d占15.66%, 增长达到5倍以上.而Limnobacter在EGSB反应器中的比例先下降后升高, 在EGSB运行至177 d达到最低, 只占0.95%, 而到384 d时增长到9.01%与接种污泥中所占比例相当.而在UASB反应器中增长到15.50%, 是EGSB反应器中的1.7倍, 有所差异.Denitratisoma是反硝化菌, 在缺氧状态下完成反硝化作用, 需要消耗有机碳源, 由于厌氧氨氧化反应是产生硝态氮的过程, 反应器中也存在细胞代谢或微生物死亡后的有机物, 可被反硝化菌利用将硝态氮转化为亚硝进而转化为氮气进一步提高氮的去除率.Limnobacter属经常在各种环境, 如表面海水, 大洋深处, 人体肠道, 和火山沉积物中被发现.该属目前只有L. thiooxidans和L. litoralis两个种被分离和鉴定, 这两个物种都是异养的, 在有机底物(如琥珀酸盐)存在下, 耗氧并将硫代硫酸盐氧化成硫酸盐获得额外能源.Chen等的研究发现在厌氧甲烷氧化(anaerobic methane oxidizing, AOM)环境中, Limnobacter菌株可能以通过AOM活性产生的有机物质为生, 随后可能通过提供硫氧化产生的硫酸盐而对AOM群落做出贡献.

 

图 6 各样品细菌分类(属)的群落组成相对百分比

　　在浮霉菌门中共检测出3种主要属, 其中Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia属是厌氧氨氧化菌, 接种污泥中Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia属所占比例为1.95%和0.32%.在EGSB反应器运行第53、177和384 d时Candidatus Brocadia占比分别为11.25%、10.63%和7.53%(表 3), 说明在运行初期Candidatus Brocadia属能够快速富集, 而随着氮负荷的升高, 所占比例有所降低;而Candidatus Kuenenia属在占比也有所增长分别为1.21%、0.89%和1.61%, 在EGSB反应器中Candidatus Brocadia属比例始终高于Candidatus Kuenenia属.UASB反应器中不同, 384 d时, Candidatus Brocadia属占比为3.69%, 而Candidatus Kuenenia属为7.54%, 说明在UASB反应器中厌氧氨氧化的优势属种为Candidatus Kuenenia属.

 

表 3 不同研究中EGSB和UASB反应器厌氧氨氧化优势菌属

　　对于反应系统中ANAMMOX的优势菌种, 有研究发现Candidatus Brocadia在NO2--N浓度高于17~30μmol·L-1时Candidatus Brocadia较Candidatus Kuenenia具有更高增殖速率, 属于生长率高但基质亲和力差的r-对策;而Candidatus Kuenenia较Candidatus Brocadia对NO2--N的亲和力更强, 可以利用较低浓度的亚硝态氮, 而且具有更高的耐受NO2--N抑制能力, 属于生长率低但基质亲和力好的k-对策.不同属厌氧氨氧化菌适宜生存环境不同, 在不同的上升流速下, 反应器内污泥浓度以及废水中营养成分、微量元素等的分布均不相同, 也会造成厌氧氨氧化菌优势菌种存在差异或优势菌属的迁移.例如谭锡诚等的研究中发现随着进水氨氮浓度的提高, 反应系统中ANAMMOX的优势菌种由Candidatus Brocadia(100%)转变为Candidatus Jettenia(50%)和Candidatus Kuenenia(30%)的混合菌种.佟智达的研究发现在0.5、2、5、8 m·h-1的不同上升流速下, 富集得到的厌氧氨氧化菌中优势菌种不同, 分别为Candidatus Kuenenia、Asahi BRW2、Candidatus Brocadia和Candidatus Anammoxoglobus属.目前, 在厌氧氨氧化富集过程中菌种改变的原因还未有定论, 还需要做进一步分析.

　　2.2.4 环境条件与微生物群落之间的相关性

　　典范对应分析(CCA)用于评估环境条件对各种系统中微生物群落动态的影响.CCA的结果揭示了环境参数与5个样本之间的相关性, 如图 7所示.厌氧氨氧化颗粒污泥培养过程中的细菌群落结构发生改变, 其中EGSB第177 d的菌落结构差异性最大, 随着培养时间增长, 微生物适应性增强, 群落结构差异减小.分析表明优势菌属Candidatus Brocadia与v、NRR存在较强正相关而与HRT呈较强负相关, Candidatus Kuenenia与NRE、NRR、HRT成正相关, 而与v呈负相关.

 

 图 7 水质参数与菌群结果的典范对应分析

　　3 结论

　　(1) EGSB和UASB反应器运行至384 d, 厌氧氨氧化颗粒污泥平均粒径分别为1.17 mm和1.21 mm, 其中0.2~1.5 mm粒径范围的颗粒占比最大, 分别为58.90%和60.05%.UASB反应器中>3 mm的粒径占比多于EGSB反应器, 分别为8.64%和1.66%, 表明UASB反应器低速的水力条件更容易培养出粒径大的颗粒污泥.

　　(2) 在厌氧氨氧化颗粒污泥培养期间, 污泥颜色由棕色变为深红褐色, 扫描电镜结果表明不同运行条件下的污泥菌群以短杆菌、球型菌为主.变形菌门是主要优势菌群, 同时浮霉菌门含量大幅提高.Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia属是厌氧氨氧化颗粒污泥主要菌属, 在EGSB反应器中Candidatus Brocadia属是优势菌属占7.53%, 而UASB反应器中Candidatus Kuenenia属是优势种群, 占7.54%.

　　(3) 优势菌属Candidatus Brocadia丰度与v、NRR存在较强正相关而与HRT呈较强负相关, Candidatus Kuenenia丰度与NRE、NRR、HRT成正相关, 而与v呈负相关.(来源：苏州科技大学环境科学与工程学院 作者： 姜滢)

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